春節(jié)假期將至，對(duì)于科研人來(lái)說(shuō)這可是又愛(ài)又恨：一個(gè)假期回來(lái)，原本生龍活虎的細(xì)胞瞬間“暴斃”。
那么導(dǎo)致這種情況的原因有哪些？
節(jié)前養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程該注意什么？
NEST幫你劃重點(diǎn)！
幫細(xì)胞崽崽過(guò)龍年！
01細(xì)胞前期準(zhǔn)備
細(xì)胞培養(yǎng)體系中最為重要的即為細(xì)胞培養(yǎng)基。常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法便是90%基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM、1640、F12等）+10%胎牛血清。
盡管使用廣泛，但胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中面臨著諸多問(wèn)題和風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基支原體污染中的牛萊氏無(wú)膽甾原體和精氨酸支原體來(lái)源于牛血清。
因此，胎牛血清的品質(zhì)至關(guān)重要。
NEST選用南美烏拉圭血源，每一批血清的生產(chǎn)都受到嚴(yán)格的控制，從血清的收集和整個(gè)處理和生產(chǎn)的所有階段，按照符合歐洲法規(guī)進(jìn)行處理，一直到最終包裝做到全程的質(zhì)量控制。
NEST胎牛血清血源地證明
NEST胎牛血清無(wú)疫病證明
NEST胎牛血清官方原產(chǎn)地證明
此外，NEST每一批血清都會(huì)進(jìn)行完善的檢測(cè)。
1. 支原體：每產(chǎn)品批次都要檢測(cè)有無(wú)支原體。通過(guò)培養(yǎng)方法檢測(cè)血清是否存在支原體。
2. 無(wú)菌性：產(chǎn)品均基于歐洲藥典或美國(guó)藥典進(jìn)行無(wú)菌性檢測(cè)，確保無(wú)細(xì)菌、酵母、大腸桿菌噬菌體等。無(wú)菌過(guò)濾、無(wú)菌分裝，每生產(chǎn)批次中均會(huì)抽樣進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。
3. 血紅蛋白：血紅蛋白具有氧化性，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損。采用分光光度計(jì)測(cè)量殘留血紅蛋白水平。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)：每批胎牛血清都被測(cè)試特定細(xì)胞系的體外培養(yǎng)效果。從細(xì)胞生長(zhǎng)、鋪板效率、克隆效率三方面評(píng)判。測(cè)試細(xì)胞種類(lèi)：HeLa，L929，SP2/0-AG14，MRC-5
選用指南
02細(xì)胞凍存操作
細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。
凍存管一般用作低溫儲(chǔ)存，是常用的實(shí)驗(yàn)耗材，多用于生物、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。采用醫(yī)用聚丙烯(PP)為原料，在液氮?dú)庀嗟某蜏丨h(huán)境下,可耐低溫至零下196℃。
耐思凍存管分常規(guī)無(wú)碼凍存管、二維碼凍存管和三碼合一SBS凍存管三種系列，具備完整的穩(wěn)定性與安全性驗(yàn)證報(bào)告。
細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)。
因此，細(xì)胞凍存液至關(guān)重要。
NEST細(xì)胞凍存液改良優(yōu)勢(shì)
選用指南
細(xì)胞凍存操作指南（排版的時(shí)候使用上下滑動(dòng)查看文字的模板）
1. 貼壁細(xì)胞制備細(xì)胞懸液：(懸浮細(xì)胞請(qǐng)忽略此步驟)
(1) 將舊培養(yǎng)基吸除,用PBS清洗兩遍。
(2) 在培養(yǎng)瓶中加入少許胰酶,以能覆滿瓶底為限。將培養(yǎng)瓶平置于培養(yǎng)箱中消化約1~2分鐘,期間在顯微鏡下觀察,一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞變圓、比較松動(dòng)后,立即終止消化(個(gè)別難消化細(xì)胞需要延長(zhǎng)消化時(shí)間,但要避免消化過(guò)度)。
(3) 加入適量溫浴好的完全培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打均勻細(xì)胞。
2. 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的凍存：
(1) 取少量細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù),算出細(xì)胞總數(shù)和所需細(xì)胞凍存液的量。細(xì)胞的凍存密度以1×10^6~2×10^7 cells/ mL為宜。
(2) 將所需量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)離心管中,200~500×g,離心3-5分鐘, 棄上清收集細(xì)胞。（離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型）
(3) 向細(xì)胞沉淀中加入適量無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液,用移液器輕輕吹打以重懸細(xì)胞,分裝于無(wú)菌細(xì)胞凍存管中,嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、日期。
(4) 直接置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存,細(xì)胞可至少保存一年;或者-80℃過(guò)夜后,次日將細(xì)胞投入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
03細(xì)胞復(fù)蘇操作
1. 自液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水浴中快速解凍。(避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡),輕搖凍存管使其在1~2分鐘內(nèi)全部融化,以75%酒精擦拭凍存管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
2. 將解凍的細(xì)胞懸液移至15mL無(wú)菌離心管中,再加入5~10mL預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基,輕輕混合均勻,200~500×g,離心3-5分鐘,棄上清收集細(xì)胞。(離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型)
3. 加入預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基,混合均勻,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注：可使用耐思新推出細(xì)胞復(fù)蘇儀替代原始細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程，預(yù)熱1分鐘，催融階段1分10秒左右，解凍復(fù)蘇階段大約1分20秒左右，解凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高。
